自噬研究指南｜如何检测内质网自噬

　　上期介绍了内质网自噬的过程和关键受体，本期将主要介绍触发内质网自噬的因素及检测方法。东方project游戏官网

　　触发内质网自噬的因素

　　营养缺乏、细胞应激以及其他一些重要信号包括内质网应激的恢复、错误折叠多肽的积累、核糖体的停滞等均会触发内质网自噬。

　　营养缺乏

　　营养缺乏的情况下，细胞会激活自噬程序，其中部分细胞质内容物在溶酶体/液泡内降解为基本代谢物，从而形成内部营养物质库。目前发现的大多数内质网自噬受体，如FAM134、RTN3L、TEX264等都是在细胞处于营养缺乏的条件下发现的。

　　细胞应激

　　细胞稳态受到干扰会激活一组称为内质网应激传感器的内质网膜蛋白的翻译后修饰，从而触发下游信号特异性转录和翻译程序，最终会增加内质网大小、内质网驻留蛋白质水平及整体内质网活性。如果干扰持续存在，则会触发内质网自噬，以防止内质网过度扩增，从而避免细胞凋亡。

　　其他重要信号

　　内质网从应激中恢复、错误折叠蛋白在内质网中积累、核糖体的停滞和病原体入侵都会触发内质网自噬unheard疑案追声下载。

　　药物治疗通过扰动钙或氧化还原稳态而引起内质网应激，内质网大小增加[1]。药物治疗中断后，内质网从应激中恢复，多余的内质网会被递送至溶酶体中降解，这一类型的内质网自噬受SEC62蛋白的调节[2]ulb sans模拟器。

　　错误折叠的蛋白对细胞有***性，通过统称为内质网相关降解（ER-associated degradation，ERAD）的分解代谢过程被细胞质蛋白酶体降解（图1）。未能进入ERAD系统的错误折叠多肽在内质网常驻分子伴侣的干预下被分离到专门的内质网子结构域，而内质网伴侣分子又与内质网自噬受体结合。这激活了内质网自噬反应，促进这部分内质网的囊泡化及随后的溶酶体降解。这些过程被称为内质网-溶酶体相关降解（ER-to-lysosome-associated degradation，ERLAD）（图2）[3]。

　　新合成的蛋白质通过转座子转位到内质网，当核糖体停留在有缺陷的mRNA上时，转座子被阻断功能失调，进而激活内质网自噬反应[5]。

　　病原体如胞内革兰氏阳性菌入侵，其释放的环状二磷酸腺苷激活内质网膜蛋白STING，触发内质网应激，内质网自噬被激活，从而阻止内质网应激诱导的细胞凋亡[6]。

　　内质网自噬的检测方法

　　为阐明内质网自噬的分子机制、生理和病理作用以及寻找调节内质网自噬的药物，监测内质网自噬活性十分重要。

　　透射电子显微镜可以观察内质网自噬，但无法衡量内质网自噬活性。一些内源性内质网蛋白（如RTN1、RTN3、RTN4、REEP5、CLIMP63和Trap-α）在自噬中表达水平下降，但变化通常很小。相比之下，饥饿诱导的内质网自噬受体蛋白（如CCPG1和TEX264）的降解更明显，但它们是选择性降解的，并且在内质网自噬过程中也可能被诱导转录表达，不能准确反应内质网自噬水平。因此荧光标记的报告载体是自噬研究最常用的手段，基于此汉恒生物推出了以下内质网自噬监测工具（表1）。召唤之夜6

　　通过将内质网定位序列与RFP-GFP荧光串联序列融合表达来构建内质网自噬报告载体ssmRFP1-EGFP-KDEL（ss：内质网信号肽序列，ER signal sequence；KDEL内质网滞留序列）（图3A）和mCherry-EGFP-RAMP4（RAMP4：即SERP1基因，Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1，可以特异性定位到内质网膜上）（图3B）。在细胞质中，红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白同时表达，表现为***；若发生内质网自噬，由于溶酶体偏酸性的环境，绿色荧光蛋白淬灭，只剩下红色荧光信号。此外，在溶酶体中，报告载体ssmRFP1-EGFP-KDEL中的mRFP1与EGFP间的linker会被剪切，因此也可通过Western Blot结果统计mRFP1/mRFP1-EGFP比值来指示内质网自噬。

　　除内质网自噬外，汉恒生物还可提供监测高尔基体自噬和溶酶体自噬，以及定位各个细胞器的工具病***，若有细胞器自噬相关的技术问题，欢迎咨询汉恒生物！

　　参考文献：

　　[1] Bolender, R P., Weibel, E R.. A morphometric study of the removal of phenobarbital-induced membranes from hepatocytes after cessation of threatment. The Journal of cell biology, 1973, 56(3):746-61.

　　[2] Linxweiler, Maximilian., Schick, Bernhard., Zimmermann, Richard.. Let's talk about Secs: Sec61, Sec62 and Sec63 in signal transduction, oncology and personalized medicine扑翼机. Signal transduction and targeted therapy, 2017, 2:17002.

　　[3] Wilkinson, Simon.. ER-phagy: shaping up and destressing the endoplasmic reticulum. The FEBS journal, 2019, 286(14):2645-2663.

　　[4] Reggiori, Fulvio., Molinari, Maurizio., Molinari, Maurizio.. ER-phagy: mechanisms, regulation, and diseases connected to the lysosomal clearance of the endoplasmic reticulum. Physiological reviews, 2022, .

　　[5] Liang, Jin Rui., Lingeman, Emily., Luong, Thao., Ahmed, Saba., Muhar, Matthias.. A Genome-wide ER-phagy Screen Highlights Key Roles of Mitochondrial Metabolism and ER-Resident UFMylation. Cell, 2020, 180(6):1160-1177.e20.

　　[6] Moretti, Julien., Roy, Soumit., Bozec, Dominique., Martinez, Jennifer., Chapman, Jessica R..  STING Senses Microbial Viability to Orchestrate Stress-Mediated Autophagy of the Endoplasmic Reticulum. Cell, 2017, 171(4):809-823.e13.